雞角膜蛋白(KERA) ELISA 試劑盒

雞角膜蛋白(KERA) ELISA 試劑盒產品說明:

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雞角膜蛋白(KERA) ELISA 試劑盒

雞角膜蛋白(KERA) ELISA 試劑盒

一、標本的采集及保存

?1.血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過一晚后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。?

2.血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。?

3.細胞培養物上清或其它生物標本：1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

?注：標本溶血會影響檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

雞角膜蛋白(KERA) ELISA 試劑盒?

二、標本的稀釋原則

? ? ? 首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當的稀釋倍數。只有稀釋至標準曲線的范圍內，檢測的結果才是準確的。稀釋的過程中，應做好詳細的記錄。計算濃度時，稀釋了“N”倍，標本的濃度應再乘以“N”。?

1.標準品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為300 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋300 pg/ml，150 pg/ml，75 pg/ml，37.5 pg/ml，18.5 pg/ml，9 pg/ml，4.5 pg/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/ml，臨用前15分鐘內配制。 如配制150 pg/ml標準品：取0.5ml（不要少于0.5ml）300 pg/ml的上述標準品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

2.生物素標記抗體的稀釋原則： 臨用前以生物素標記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素標記抗體加990μl生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。

3.辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則： 臨用前以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標記親和素加990μl辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。 操作步驟 實驗開始前，請提前配置好所有試劑，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。?

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三、操作步驟

1.加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔分別加標準品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘。 為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2.棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標記抗體工作液 100μl（取1μl生物素標記抗體加99μl生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制），37℃,60分鐘。?

3.溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。?

4.每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同生物素標記抗體工作液） 100μl，37℃，60分鐘。?

5.溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。?

6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。?

7.依序每孔加終止溶液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。?

8.用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內進行檢測。?

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四、試劑盒使用小技巧

1. 用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數分鐘，以便試劑集中到管底。

2. 每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是**加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調OD值至零。?

3. 為防止樣品蒸發，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜。?

4. 未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存。標準品、生物素標記抗體工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液請依據所需的量配置使用。請勿重復使用已稀釋過的標準品、生物素標記抗體工作液或、辣根過氧化物酶標記親和素工作液。?

5. 建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。 洗板方法 手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內，浸泡1-2分鐘。根據需要，重復此過程數次。 自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。 計算 以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。?

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五、技術小提示

1.當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。

2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。?

3. 一次加樣時間**控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。?

4. 請每次測定的同時做標準曲線，**做復孔。?

5. 如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請**乘以稀釋倍數。?

6. 在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。?

7. 底物請避光保存。?

8. 不要用其它生產廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。?

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六、注意事項

1.收集標本前必須清楚要檢測的成份是否足夠穩定。對收集后當天進行檢測的標本，儲存在4 ℃備用，如有特殊原因需要周期收集標本， 將標本及時分裝后放在-20 ℃或-70 ℃條件下保存。避免反復凍融。

2.標本2 -8 ℃可保存48 小時，-20 ℃可保存1 個月。-70度可保存6 個月。

3.部分激素類標本需添加抑肽酶。?

4.計算方法：以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。?

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七、試劑盒性能

1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.92以上。

2.批內與批見應分別小于9%和15%?

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八、保存條件及有效期

1.試劑盒保存：2-8℃。?

2．有效期：6個月

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